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Solarbio-酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：試劑盒采用酶法破碎酵母細(xì)胞壁和堿裂解法裂解酵母細(xì)胞來(lái)提取酵母質(zhì)粒 DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細(xì)胞壁，提高酵母質(zhì)粒 DNA 的產(chǎn)量。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附 DNA，可限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。使用本試劑盒提取的酵母質(zhì)粒 DNA 可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。本試劑盒無(wú)需使用酚等有毒試劑，操作安全。操作步驟： 1、取 1-5ml 酵母培養(yǎng)物（不超過(guò) 5×107 cells），12000rpm 離心 1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。 2、酵母細(xì)胞壁的破除： A、酶法：向酵母菌體中加入 470ul 山梨醇 Buffer，充分懸浮菌體，加入 25ul 酵母破壁酶和 5ul 巰基還原劑，充分混勻，30℃處理 1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm 離心 1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入 250ulYP1（請(qǐng)先檢查是否已加入 RNaseA），充分懸浮沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。  B、玻璃珠法：向酵母菌體中加入 250ul YP 1（請(qǐng)先檢查是否已加入 RNaseA），充分懸浮沉淀。加入 150-200ul 酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩 10min。簡(jiǎn)短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請(qǐng)用 YP 1 補(bǔ)足 250ul）于另一干凈離心管中。 3、向離心管中加入 250ul YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組 DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要超過(guò) 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。 4、向離心管中加入 350ul YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm 離心 10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：YP3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。 5、將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 6、向吸附柱中加入 600ul 漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入 600ul 漂洗液，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 8、12000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR 等。 9、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 50-200ul 經(jīng) 65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置 2min， 12000rpm 離心 1min。 10、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心 1min。

Solarbio-酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒

注意事項(xiàng)：

1、使用前請(qǐng)先檢查 YP2 和 YP3 是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。 2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 50ul，體積過(guò)小影響回收效率；洗脫液的 pH 值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)此范圍)，pH 值低于 7.0 會(huì)降低洗脫效率；DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA 降解。 3、質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)粒拷貝數(shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。通常酵母質(zhì)粒拷貝數(shù)都很低，一般通過(guò)電泳或分光光度計(jì)法都很難檢測(cè)到，可通過(guò) PCR 或轉(zhuǎn)化大腸桿菌來(lái)檢測(cè)。 4、DNA 濃度及純度檢測(cè)：得到的基因組 DNA 片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)?；厥盏玫降?DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。DNA 應(yīng)在 OD260 處有顯著吸收峰， OD260 值為 1 相當(dāng)于大約 50 μg/ml 雙鏈 DNA、40 μg/ml 單鏈 DNA。OD260/OD280 比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)?pH 值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。